免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測定含量。

　　免疫熒光實驗的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要，原因很簡單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外，抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。

　　由于操作步驟比較多，同時在分析結(jié)果時無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個免疫熒光實驗結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對實驗條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒瀸φ??？傊庖邿晒鈱嶒瀼募?xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實驗流程中每個步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實驗?zāi)康摹?/p>

　　免疫熒光實驗基本實驗步驟：

　　細(xì)胞準(zhǔn)備

　　對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm，5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

　　固定

　　根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮鈉的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3*5次。

　　通透

　　使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3*5min。

　　封閉

　　使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時間一般為30min。

　　一抗結(jié)合

　　室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。

　　二抗結(jié)合

　　間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

　　封片及檢測

　　滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

　　免疫熒光實驗步驟技巧

　　封閉:

　　將組織切片自-20℃冰箱取出，室溫靜置15 min（可采用免疫熒光封閉用筆在組織周圍畫圈以避免抗體擴(kuò)散），隨后采用1×PBS洗三次，每次5 min，最后采用blocking buffer（綿羊血清5%，0.3%Triton-100，采用1×PBS稀釋可得）室溫封閉1 h。

　　一抗孵育：

　　濾紙吸掉玻片上的封閉液（吸取的時候要注意不要碰到組織樣本），并滴加blocking buffer配置的待測抗體，將玻片置于濕盒中，4℃孵育過夜。既然是濕盒，應(yīng)該都知道里面要加水防止抗體蒸發(fā)的吧，嗯嗯，聰明的你們肯定知道。

　　二抗孵育：

　　第二天把濕盒從冰箱拿出來(一般來說大部分的染色可直接做下面的步驟，如果待測蛋白比較難染色，可將濕盒置于室溫繼續(xù)孵育一段時間，時長自己定)，回收一抗(土豪的話就隨意)，1×PBS滴加到玻片上，洗三次，每次3 min，隨后吸取多余的1×PBS。

　　接下來所有的操作均在避光條件下進(jìn)行，這很重要！

　　滴加二抗（同樣用blocking buffer配置哦），室溫孵育1 h。

　　染核：

　　吸掉二抗，滴加DAPI孵育3-5 min，1×PBS同上方法洗三次。

　　最后用濾紙吸取多余的液體，用含有抗淬滅劑的封片劑封片（有小伙伴用指甲油，也行），避光保存后即可在顯微鏡下觀察染色的情況。